做好这6步，JC-10实验轻松获得稳定结果
发布时间：2026年8月18日
JC-10通过绿色/橙色荧光比值反映线粒体膜电位变化，是目前常用的线粒体功能检测方法之一。为了帮助大家快速建立实验流程，本文结合JC-10的使用特点与实际应用经验，总结从样品制备、染色、检测到数据分析的关键操作要点，供实验参考。
一、实验前需要准备哪些材料？
- JC-10 染料（母液溶于无水 DMSO，-20℃ 避光分装保存）
- HBSS 缓冲液（含 HEPES）或 PBS
- 黑色透明底96孔板（酶标仪检测）或流式管（流式检测）
- 阳性对照：CCCP 或 FCCP
- 待测化合物及溶剂对照
二、JC-10工作液如何配制？
取母液回温至室温，用预温缓冲液稀释至目标浓度，涡旋混匀后立即使用。注意 DMSO 母液不可直接加入水相，需逐滴加入并边加边混，防止染料析出。
工作浓度需按细胞系优化——在已发表文献中的实际用量跨度很大：猪胎儿成纤维细胞有830 nM的报道[1]，人 Treg 细胞用 10 μg/mL [2]。建议每个细胞系先做 1–15 μM 浓度梯度预实验进行摸索。
三、不同检测平台有哪些注意事项？
以下为文献中报道的条件可供参考：
- 流式细胞仪：488 nm 激光激发，FL1 通道（~530 nm）检测绿色单体，FL2 通道（~585 nm）检测橙色聚集体；具体滤光片带宽因仪器型号而异（如 BD 系列 FL2 为 585/42 nm，Beckman Coulter 部分机型为 575/25 nm）[1]。细胞密度 1–5 × 10⁵ 个/管，37℃ 避光孵育 20–30 min，染色后 PBS 洗 2 次再上机可降低背景 [1][2]。
- 荧光显微镜：绿色单体用 FITC 滤光片组（Ex 490/Em 525 nm），橙色聚集体用 TRITC 滤光片组（Ex 540/Em 590 nm）。
- 酶标仪：单体 Ex 490/Em 525 nm，聚集体 Ex 540/Em 590 nm，黑色透明底板。Younes 等在斑马鱼胚胎毒性评价中即采用该参数组合，并证实 JC-10 灵敏度高于 AO 凋亡检测、TUNEL 和 Hsp70 Western blot [3]。
四、如何设置实验对照？
- 阴性对照： 细胞 + 等体积溶剂，确定基线比值
- 阳性对照： CCCP 或 FCCP 诱导去极化。Mordhorst 等用 CCCP 100 μM 处理 2 h 作为单体阳性对照，用于设定流式散点图纵轴阈值和补偿参数 [1]
- 背景空白： 无细胞，仅培养基 + 染料
五、结果应该如何分析？
文献中主要有两种分析策略：
象限分析法 [1]：FL2 × FL1 散点图分四象限，横轴以未染色对照设定，纵轴以 CCCP 处理组设定，报告高/低膜电位细胞群百分比及平均荧光强度。Mordhorst 等用该方法发现 CPI-613 处理后低膜电位细胞比例从 74.4% 升至 95.5% [1]。
荧光比值法[2][3][4]：计算绿/红荧光比值，比值升高代表膜电位下降。Wang 等用该方法发现重症肌无力患者 Treg 细胞绿色荧光比例显著高于对照（9.28% vs 2.73%），雷帕霉素诱导线粒体自噬后恢复至 3.21%[2]；Lyu 等用 JC-10 比值法证实中药含药血清可降低 HT-29 结肠癌细胞膜电位[4]。
建议将处理组比值归一化至阴性对照组，以百分比形式展示，便于不同批次间比较。
六、实验Tips
- 染料母液按单次用量分装，避免反复冻融
- 工作液现配现用，不建议储存
- 染色全程避光操作
- 每个细胞系单独做浓度和时间梯度预实验——文献用量从 830 nM 到 10 μg/mL 不等[1][2]
- 酶标仪检测使用板中央 60 孔，边缘孔用 PBS 填充
- 流式检测前确认细胞活率 >90%
- 每次实验务必设置 CCCP/FCCP 阳性对照 [1]
- 结果以比值形式展示，不要单独看单一通道强度[2][3]
参考文献
[1] Mordhorst BR, Kerns K, Schauflinger M, et al. Pharmacologic treatment with CPI-613 and PS48 decreases mitochondrial membrane potential and increases quantity of autolysosomes in porcine fibroblasts. Scientific Reports. 2019;9:9616. DOI: 10.1038/s41598-019-45850-4 [2] Wang N, Jiang Y, Karim MR, et al. Effects of Mitophagy on Regulatory T Cell Function in Patients With Myasthenia Gravis. Frontiers in Neurology. 2020;11:238. DOI: 10.3389/fneur.2020.00238 [3] Younes N, Alsahan BS, Al-Mesaifri AJ, et al. JC-10 probe as a novel method for analyzing the mitochondrial membrane potential and cell stress in whole zebrafish embryos. Toxicology Research. 2022;11(1):tfab114. DOI: 10.1093/toxres/tfab114 [4] Lyu RL, Dou FY, Chai MN, et al. Regulatory effects of serum containing Hedysari Radix Praeparata Cum Melle-vinegar processed Curcumae Rhizoma on mitochondrial function and mitophagy in HT-29 cells. 中国中药杂志. 2026. DOI: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20251029.402
