Nat. Commun.Sens. Actuators B：Chem.|与CRISPR/Cas12a联用的新型G-四链探针用于超灵敏和高特异性核酸检测

来源：理科趣味说

背景介绍

将CRISPR/Cas12a与高性价比的探针集成在一起对分子诊断至关重要。然而，荧光猝灭剂标记的单链DNA探针是该领域的经典工具，需要很高的生产成本。在此，研究人员为CRISPR/Cas12a开发了一种新型的无猝灭剂的荧光G-四链(G4)探针，具有高性价比。

作者思路

传统CRISPR/Cas12a核酸检测存在双标记荧光探针成本高、储存稳定性差等问题，现有G-四链体（G4）体系仅能实现信号减弱型（turn-off）荧光读出且G4自身结构稳定难以被Cas12a切割的痛点。作者基于鸟嘌呤可高效淬灭FAM荧光、G4侧翼序列能破坏其空间构象降低稳定性的原理，设计仅单FAM标记、3’端带侧翼序列的无淬灭基团G4探针（GCR），通过优化侧翼长度、碱基组成、G4四分体层数与环长获得最优探针，实现低成本信号增强型（turn-on）荧光读出。为进一步提升检测灵敏度并抑制等温扩增RPA非特异性扩增，将该GCR探针与硫代磷酸修饰dNTP辅助的高特异性S-RPA联用构建RPA/GCR检测体系，以HBV DNA为检测靶标完成体系性能验证。

图文导览

Cas12a对尾部G4的有效切割

研究假说指出线性Poly G和经典G4虽能高效淬灭荧光，但难以被Cas12a切割；而带有3’侧翼序列的尾型G4兼具荧光淬灭能力与可被Cas12a高效反式切割的特性（图 1A）。实时荧光结果证实，3’末端修饰G4（G4₂₋₁）的切割效率与荧光信号差值远优于线性poly G和普通G4（图 1B、C）。PAGE分析和底物残留率显示切割效率与实时分析一致。质谱检测进一步验证，Cas12a可将带有3’侧翼序列的尾型G4切割为约5个核苷酸的小片段，线性poly G与天然G4则基本不被切割，与电泳结果相互印证（图 1D）。

3′-端长度对Cas12a反式切割的影响

为了研究3′-末端长度对Cas12a反式切割的影响，研究人员设计了不同长度的3′-末端(图 2A)。实时荧光分析表明，7-NT 3′-尾型G4具有最佳切割效率(图 2B)，随后通过PAGE分析(图 2C)验证了这一点。此外，与其他长度相比，7-NT 3′-尾型G4显示出最显著的视觉信号差异(图 2C、D)。

碱基组成对Cas12a反式切割的影响

已有研究表明富含胞嘧啶（C）的DNA对Cas12a反式切割的效率最高，为此作者设计了携带不同碱基序列3’尾的G4探针开展对照实验(图 3A)；实时荧光检测、PAGE分析结果均证实，3’端连接多聚胞嘧啶（C）尾的G4探针拥有最强荧光信号与最显著的荧光差值，切割效果最优（图 3B-D）。

G4结构对Cas12a反式切割的影响

已有研究证实G4的四分体层数、环区长度会显著影响Cas12a反式切割效率。为此，研究人员评估了具有不同四分体层数(2-4层)的G4的反式切割效率，发现四层四分体的F4+7C探针荧光淬灭与切割效果最佳(图 4A-C)。同时还探究了不同环长度的影响，发现环区仅含1个核苷酸的3’尾G4拥有最优淬灭能力与切割效率(图 4D-F)。

GCR的性能

研究将优化后的带有7个胞嘧啶3’尾、四层四分体的FAM标记G4探针与CRISPR/Cas12a结合，构建了新型GCR报告体系（图 5A）。以乙肝病毒DNA为靶标进行性能测试，该体系检出限为6 nM，检测性能与传统双标记单链DNA探针相当。同时GCR可耐受血清蛋白、肝素、高盐、尿素等多种干扰物质，还能精准识别靶序列上单、双碱基错配，具备良好抗干扰能力与靶标特异性（图 5B-D）。

RPA/GCR用于临床标本检测

常规RPA等温扩增易产生非特异性扩增，已有研究证实硫代磷酸修饰dNTPαS可以增强RPA的特异性，得到高特异性S-RPA。研究人员将S-RPA与GCR探针联用构建HBV检测体系RPA/GCR（图 6A）。先筛选得到扩增效率最优的P2引物，确定添加70% dNTPαS可彻底消除非特异性扩增并以此为标准体系（图 6B、C）。该联合检测体系最低可检出10 copies/μL的HBV DNA，无交叉反应（图 6D、E）。对100份临床血清样本（50份HBV阳性、50份HBV阴性）进行检测分析，灵敏度与特异性均达100%，无假阳、假阴性结果，具备优秀临床应用潜力（图 6F、G）。

总结

与传统的关闭CRISPR/Cas12a/G4系统相比，研究人员开发的这款G4辅助CRISPR/Cas12a报告器（GCR）创新地实现了具有成本效益的开机信号输出。将GCR与先前开发的dNTPαS辅助RPA整合，建立了RPA/GCR检测方法。该检测法实现了超灵敏度和单碱基鉴别能力，使HBV DNA检测能够与qPCR结果100%一致。

笔者总结

研究人员开发了一种新颖的CRISPR/Cas12a/G4信号输出策略，建立了实用的RPA/GCR测定方法，在感染性疾病分子诊断领域具备广阔应用潜力。