JC-10线粒体膜电位荧光探针实验操作指南

一、产品概述

JC-10是一种电位敏感性荧光探针，广泛用于检测线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP, ΔΨm）的变化。它是经典探针JC-1的改良版本，具有更好的水溶性和更低的细胞毒性，在凋亡检测、细胞活力评估、药物筛选等领域有重要应用。

Purescix JC-10采用自主合成工艺，纯度≥98%，经细胞水平功能验证，染色效果稳定、信噪比高，适用于流式细胞术和荧光显微镜/共聚焦成像检测。

二、检测原理

JC-10是一种阳离子亲脂性荧光染料，能够选择性地进入线粒体，其聚集程度依赖于线粒体膜电位的高低：

JC-10带正电，依靠线粒体内膜内侧的负电位（线粒体跨膜电位 ΔΨm）富集；细胞膜电位不影响其线粒体靶向性，本探针特异性检测线粒体膜电位变化。

• 可被488 nm激光激发（红通道也可用561 nm激光增强信号），发射~595 nm
• 可被488 nm激光激发，发射~525 nm

线粒体膜电位下降时，红色荧光减弱，绿色荧光增强。通过检测红/绿荧光强度的比值（比率法），可以准确定量线粒体膜电位的相对变化。比率法的优势在于不受探针浓度、细胞大小、仪器参数等因素的干扰，结果更加稳定可靠。

JC-10相比经典JC-1的改进：水溶性更好，不易聚集沉淀；细胞毒性更低；染色背景更低；在不同细胞系中的适用性更广。

三、适用实验类型

• 细胞凋亡检测（线粒体膜电位下降是凋亡早期标志性事件）
• 线粒体功能研究与膜电位定量分析
• 细胞毒性与药物安全性评价
• 氧化应激与线粒体损伤研究
• 肿瘤药物筛选（促凋亡活性评价）
• 干细胞质量评估
• 流式细胞术高通量检测
• 荧光显微镜/共聚焦活细胞成像

四、储存液配制

4.1 储存液浓度：推荐配制 1 mM（1000×）的储存液

4.2 溶剂：无水DMSO（二甲基亚砜）

4.3 配制方法：

将JC-10粉末从-20℃取出，室温回温2-3分钟，避免冷凝水

按粉末净重计算，加入适量无水DMSO，配制成1 mM储存液

盖紧管盖，轻柔涡旋振荡1-2分钟至完全溶解

分装为单次使用小体积（如10 μL/管），-20℃避光密封冻存

有效期：分装冻存可稳定6个月，避免反复冻融

4.4 注意事项：

• JC-10在DMSO中稳定性较好，但仍需避光保存纯无水DMSO配制的JC-10储存液-20℃会凝固；若未冻结，提示DMSO吸水受潮，该管探针建议弃用，水分会大幅降低探针稳定性
• 工作液必须现配现用，水溶液中JC-10稳定性较差
• 最终工作体系中DMSO浓度应≤0.5%，避免细胞毒性

五、流式细胞术检测操作流程

5.1 适用场景：高通量定量检测大量细胞的线粒体膜电位变化

5.2 试剂准备：

JC-10工作液：用预热的完全培养基稀释1 mM储存液至工作浓度（推荐1-10 μM）10 μM，15–30 min

5.3 操作步骤：

细胞准备：收集待检测细胞（悬浮细胞直接收集，贴壁细胞用胰酶消化），PBS洗涤一次

细胞计数：调整细胞浓度为1×10⁶/mL左右

探针染色：取适量细胞悬液（建议1×10⁶细胞/管），加入预热的JC-10工作液，用完全培养基补足至固定终体积（如500 μL），使探针终浓度为2–5 μM，轻轻混匀

孵育：37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育15-30分钟

用预热的完全培养基洗涤1次，再用PBS重悬；尽量减少PBS孵育时间，避免膜电位人为下降

重悬：用300-500 μL PBS重悬细胞，置于冰上避光

流式检测：1小时内上机检测，使用FITC通道（FL1）检测绿色荧光，PE通道（FL2）检测红色荧光

5.4 流式通道设置：

• 绿色荧光（单体）：激发488 nm，发射525/40 nm（FL1/FITC通道）
• 红色荧光（聚集体）：激发488/561 nm，发射585/40 nm（FL2/PE通道）
• 补偿：由于JC-10的绿色和红色荧光有部分重叠，建议做单染补偿

六、荧光显微镜/共聚焦成像操作流程

6.1 适用场景：观察细胞形态、线粒体分布与膜电位的空间关系

6.2 试剂准备：JC-10工作液（用完全培养基稀释至终浓度1-5 μM）

6.3 操作步骤：

细胞接种：将细胞接种在共聚焦培养皿或盖玻片上，培养至融合度50%-70%

换液：吸出旧培养基，加入预热的含JC-10的培养基（终浓度1-2 μM）

孵育：37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育20-30分钟

洗涤：吸出探针工作液，用预热的PBS或培养基轻轻洗涤1次

加入预热的新鲜培养基或含葡萄糖的Hank’s缓冲液（长时间成像建议用完全培养基）Cy3/TRITC

6.4 成像参数参考：

• 绿色通道：激发488 nm，发射500-550 nm
• 红色通道：激发543/561 nm，发射570-620 nm
• 尽量使用低激光功率，减少光漂白和光损伤
• 活细胞成像需保持37℃和5%CO₂环境

七、结果分析与判断

7.1 比率法计算：线粒体膜电位水平 = 红色荧光强度 / 绿色荧光强度

7.2 结果判读：

比值升高 → 线粒体膜电位升高（细胞状态良好或超极化）；需排除细胞体积缩小、洗涤不足等人为假象

• 比值降低 → 线粒体膜电位下降（细胞凋亡早期或线粒体功能损伤）
• 比值不变 → 线粒体膜电位无显著变化

7.3 流式数据分析：

在FSC/SSC图中圈出活细胞群，排除碎片和团块

在FL1（绿）vs FL2（红）散点图上，正常细胞主要分布在右上象限（高红高绿但红更强）

膜电位下降的细胞，红色荧光减弱，绿色荧光相对增强，向右下象限偏移

可定量分析膜电位下降细胞的百分比

7.4 成像数据分析：

可用图像软件计算每个细胞的红绿荧光比值

正常细胞线粒体区域呈明亮红色荧光，胞质绿色荧光较弱

膜电位下降时，红色变弱，绿色增强，整体偏绿

八、各实验场景浓度速查表

九、常见问题与解决方案

9.1 红色荧光弱、几乎都是绿色

可能原因：染色温度低于37℃（最常见人为因素）、线粒体膜电位确实低（细胞状态差）、探针浓度不够、孵育时间不足、探针失效

解决方案：设置阳性对照（未处理的健康细胞）验证；适当提高探针浓度或延长孵育时间；新配工作液

9.2 背景高、信噪比低

可能原因：游离探针未洗干净、探针浓度过高、细胞碎片多

解决方案：增加洗涤次数；降低探针浓度；优化细胞制备，减少死细胞和碎片

9.3 成像过程中信号迅速下降

可能原因：光漂白（JC-10聚集体光稳定性一般）、激光功率过高

解决方案：降低激光功率；减少扫描时间和次数；先找好视野再正式成像；活细胞成像可在培养基中添加活细胞专用抗荧光淬灭剂

9.4 流式结果分群不清

可能原因：探针浓度不合适、孵育时间不足、细胞状态差、补偿未调好

解决方案：优化探针浓度和孵育时间；确保细胞状态良好；用单染管做好荧光补偿

9.5 不同批次结果差异大

可能原因：细胞密度不同、传代次数不同、探针储存条件不一致

解决方案：统一细胞培养条件和接种密度；设置内参或同批次阳性对照；探针分装保存避免反复冻融

十、注意事项与实验技巧

• 全程避光：JC-10对光敏感，从配制到检测全程尽量避光操作
• 现配现用：工作液必须新鲜配制，水溶液中不稳定
• 温度控制：染色和检测过程保持37℃，温度下降会影响线粒体膜电位
• CCCP（5–10 μM，处理15–30 min）
• DMSO控制：DMSO终浓度不超过0.5%，高浓度DMSO本身会影响细胞和膜电位
• 胰酶消化要轻柔：贴壁细胞消化时避免过度胰酶处理，否则会造成膜电位人为下降
• 检测及时：染色后1小时内完成检测，放置过久信号会衰减
• 比率法定量：务必使用红/绿荧光比值进行定量，不要只看单一通道的绝对强度