D-荧光素钾盐实验应用指南

一、产品概述

产生波长约560 nm的生物发光信号（酸性条件或37℃下发射峰可红移至600 nm以上，信号强度有所下降）

Purescix D-荧光素钾盐采用自主合成工艺，纯度≥99%，经细胞水平生物发光活性验证，确保每批次产品发光效率稳定可靠。

二、检测原理

D-荧光素在荧光素酶（Luciferase）催化下发生两步反应：

第一步：在ATP和Mg²⁺存在下，D-荧光素被腺苷化生成荧光素-AMP中间体，并释放焦磷酸（PPi）。

发出波长560 nm的黄绿色光（pH中性时发射峰约560 nm；酸性条件下发射峰红移至600 nm以上，总光强下降）

由于生物发光不需要激发光，背景信号极低，检测灵敏度可达单个细胞水平，是活体动物成像和报告基因检测的金标准方法。

三、适用实验类型

• 活体生物发光成像（in vivo bioluminescence imaging, BLI）
• 体外细胞荧光素酶报告基因检测
• 细胞活力与细胞毒性检测（基于ATP含量，需配合外源荧光素酶试剂盒；与Luc报告基因体系不同）
• 启动子活性与信号通路研究
• 肿瘤生长与转移的活体监测
• 干细胞移植与示踪研究
• 药物疗效的体内外评估

四、储存液配制

4.1 储存液浓度：推荐配制 15 mg/mL（约50 mM）的储存液

4.2 溶剂：无菌DPBS（pH 7.2-7.4，体内实验推荐严格控制pH 7.2-7.4）或无菌生理盐水

4.3 配制方法：

将D-荧光素钾盐粉末从-20℃取出，室温回温2-3分钟

按目标浓度加入无菌DPBS或生理盐水，盖紧管盖

轻柔涡旋振荡1-2分钟至完全溶解，溶液呈淡黄色透明液体

经0.22 μm无菌滤膜过滤除菌（体内实验必须）

分装为单次使用体积，-20℃避光冻存，可稳定保存3个月

4.4 注意事项：

• D-荧光素水溶液稳定性低于干粉，建议分装冻存，避免反复冻融
• 全程避光操作：从干粉保存、溶液配制到实验操作均需避光，光照会加速底物氧化降解，反复冻融不超过3次，每次室温短时间避光溶解（禁止37℃水浴融化），使用后立即放回-20℃，体内实验用储存液必须无菌过滤；体外长时间孵育（＞24 h）实验也建议过滤除菌
• 储存液颜色加深或出现沉淀时应停止使用
• 干粉保存：-20℃密封干燥避光储存，防止吸潮降解；称量前室温回温，避免冷凝水

五、体外细胞实验操作流程

5.1 适用场景：荧光素酶报告基因检测、细胞活力测定

5.2 试剂准备：

• D-荧光素工作液：用培养基或PBS稀释至工作浓度（推荐100-500 μM）
• 细胞裂解液（如需要）

5.3 操作步骤：

细胞接种：将表达荧光素酶的细胞接种到96孔板或培养皿中，培养至合适密度

加药处理：按实验设计进行药物干预或其他处理

工作液配制：用预热的培养基或专用裂解缓冲液配制D-荧光素工作液，终浓度150 μM

25℃室温（或37℃）孵育5-10分钟，温度保持一致后放入化学发光酶标仪检测

数据分析：以发光强度（RLU）反映荧光素酶活性或细胞活力

5.4 浓度参考：

• 报告基因检测：常用100-300 μM
• 细胞活力检测（ATP检测）：为外源添加荧光素酶的试剂盒体系，与Luc稳转细胞报告基因实验体系不同，需配合专用裂解液和反应体系

六、活体成像实验操作流程

6.1 适用场景：荷瘤小鼠活体成像、肿瘤转移监测、干细胞示踪

6.2 试剂准备：

• D-荧光素工作液：用无菌生理盐水配制，浓度15 mg/mL（约50 mM）
• 现配现用或使用分装冻存的储存液

6.3 给药剂量与途径：

• 腹腔注射（i.p.）：150 mg/kg体重，最常用，发光峰值约10-20分钟
• 尾静脉注射（i.v.）：50-100 mg/kg体重，发光峰值约2-5分钟（底物清除快，适合快速瞬时成像，不适合长时间动态观测）
• 皮下注射（s.c.）：局部注射，用于局部区域成像

6.4 操作步骤：

动物麻醉：用异氟烷或戊巴比妥钠麻醉实验动物
注射体积约10 μL/g体重（腹腔注射推荐10 mL/kg，单次不超过20 mL/kg）
等待峰值：腹腔注射后等待10-20分钟（建议预实验确定最佳时间点）
活体成像：将动物放入成像仪，选择生物发光模式采集图像
数据分析：用成像软件对发光区域进行定量分析（总光子数或区域光强）

6.5 关键注意事项：

• 不同部位肿瘤的发光峰值时间不同，需预实验确定最佳成像时间点
• 腹腔注射位置准确，避免注入胃肠道或膀胱导致背景信号
• 小鼠毛发会显著衰减信号（黑色毛发衰减远大于白毛裸鼠），成像前建议脱毛；注意脱毛剂刺激皮肤会产生非特异背景发光
• 麻醉深度需保持一致，麻醉会影响血液循环和底物分布

注意生理状态影响：腹腔注射前禁食4-6 h可降低肠道背景发光；血糖、体温会影响底物分布与峰值，各组动物状态应保持一致每组动物数建议不少于5只，保证统计效力，必须设置未转染荧光素酶的阴性对照鼠，排除动物自体生物发光背景

七、各实验场景浓度速查表

八、常见问题与解决方案

8.1 发光信号弱或无信号

可能原因：荧光素酶表达量低、底物浓度不足、孵育/等待时间不够、底物已降解、反应体系pH偏低、细胞缺氧导致ATP不足、反应液缺Mg²⁺

解决方案：确认荧光素酶表达水平；适当提高底物浓度；延长孵育时间；新配底物工作液

8.2 信号重复性差

可能原因：细胞密度不均、加样量不一致、检测时间点不一致

解决方案：统一细胞接种密度；精准加样；固定孵育/等待时间后统一检测

8.3 体内成像信号忽高忽低

可能原因：注射剂量不准、成像时间点不一致、麻醉深度不同、肿瘤内部出血/坏死导致局部信号不均、肿瘤微环境酸化降低发光效率

解决方案：精确称量并计算给药量；每只小鼠注射后计时，统一成像时间；保持麻醉深度一致

8.4 储存液变黄变深

可能原因：氧化降解（光照或室温久置加速氧化），反复冻融或放置时间过长

解决方案：废弃不用，重新配制；加强分装管理，减少冻融次数